长江水系草鱼遗传多样性的微卫星DNA分析

利用已发表的鲤微卫星引物在草鱼中进行PCR扩增,结果有5对引物(6个座位)能成功扩增并且有较高多态性,等位基因数在3-7个之间。这些异种扩增的草鱼微卫星符合孟德尔遗传规律。测序证明草鱼中的微卫星核心重复序列部分与鲤中的原始核心序列相似,也有一些变化。随后用这6个多态微卫星座位研究了来自长江水系的四个草鱼群体的遗传结构,结果显示每个群体的平均等位基因数在38与48之间,平均观测杂合度(Ho)在04000与05741之间,平均期望杂合度(HE)在04773与06489之间,有多个座位在不同的群体中偏离哈代-温伯格平衡。遗传距离分析表明四川群体与洞庭湖群体遗传距离最远,而嘉鱼群体与鄱阳湖群体遗传距离较近。分子变异分析(AMOVA)表明,群体内遗传变异与群体间遗传变异分别占总遗传变异的9560%与440%,固定系数(FST)为0044,这表明长江水系草鱼目前的群体分化很微弱。       

草鱼肝细胞的分离与原代培养

目的以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞为实验对象,在不同条件下进行原代培养,以探讨适合草鱼肝细胞生长的最佳条件及培养方法,用于饲料营养与非营养物质对草鱼肝细胞代谢、损伤作用机制的研究。方法采用温胰蛋白酶消化法和红细胞裂解液分离、纯化肝细胞,MTT法测定细胞增殖率,并测定不同时期培养液上清液中LDH、Alb和BUN的含量,分析肝细胞生长状况。结果采用0.25%浓度的温胰蛋白酶消化法,消化20min,分步收集肝细胞,经台盼蓝染色检测和血球计数板计数,活细胞数≥99%。结论在含10%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199培养基中,以接种浓度1.7×106cell/mL左右为宜,置于27℃、4.5%CO2浓度的恒温培养箱中,可成功培养草鱼原代肝细胞。     

饥饿对草鱼非特异免疫水平的影响

研究了长期饥饿对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)非特异性免疫水平的影响。实验选取平均体质量(31.86±1.47)g的草鱼,随机分为2个实验组(对照组和饥饿组),每组3个平行,饥饿处理15、30、45和60 d,测定饥饿对草鱼头肾和脾中自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性、血清和肝胰脏中溶菌酶活性、血清中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明:受饥饿胁迫的影响,草鱼自然杀伤性细胞在脾和头肾中的杀伤活性显著低于对照组(P0.05)且不随着饥饿时间的延长发生显著性变化;随着饥饿时间的延长,血清和肝胰脏中溶菌酶呈现先升高后降低的趋势,血清碱性磷酸酶在饥饿15、45、60 d时显著低于对照组;饥饿组的碱性磷酸酶活性在饥饿30 d以后,维持恒定。由此可见,长时间的饥饿胁迫降低了草鱼的免疫水平。相比较而言,自然杀伤细胞的杀伤活性在反映鱼类免疫状况时比溶菌酶和碱性磷酸酶可能更为灵敏。     

摄食声对草鱼幼鱼的诱集作用

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼为实验对象, 进行了声音播放实验, 旨在探究草鱼幼鱼对水下录制的草鱼摄食浮萍声音(简称摄食声)的行为反应。以不播放声音的草鱼鱼群作为对照, 探讨了4 种单频音(500、1000、2000和3000 Hz)和摄食声对草鱼游泳行为和在水槽内的分布的影响。结果表明: 在播放单频音时, 3min内草鱼的趋音游泳速度和逗留时间与对照组无显著性差异(P>0.05); 在播放摄食声时, 3min内草鱼的趋音游泳速度和逗留时间显著高于4种单频音组和对照组(P<0.05); 在播放单频音时, 20min内草鱼的平均游泳速度、水槽内的分布和趋音率与对照组无显著性差异(P>0.05); 在播放摄食声时, 20min内草鱼的平均游泳速度和趋音率都显著高于4种单频音组和对照组(P<0.05)。草鱼摄食声对草鱼幼鱼有诱集作用, 为声音诱鱼技术研究提供了科学依据。     

草鱼TRAP-PCR反应体系的建立

目的:通过优化草鱼TRAP-PCR反应体系,将新型分子标记-靶位区域扩增多态性(target region amplified polymorphism,TRAP)引用到草鱼遗传多样性研究中。方法:以草鱼DNA为材料,分析了模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,以及循环参数、退火温度对TRAP-PCR扩增结果的影响。结果:确立了稳定性强、重复性好的草鱼TRAP-PCR最佳反应体系和扩增参数:在25μl的PCR反应体系中,含约50ng模板DNA,1UTaq酶,1×PCR缓冲液,2.0mmol/L MgCl2,4种dNTPs各0.2mmol/L,固定引物与随机引物各15pmol;首先使模板在94℃变性3min;然后94℃变性1min,38℃退火1min,72℃延伸lmin进行5个循环;接着94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸lmin再进行35个循环,最后72℃延伸7min。结论:TRAP-PCR反应体系稳定可靠,该新型分子标记可应用于草鱼遗传多样性研究中。     

禁食对草鱼不同组织、器官蛋白质代谢的影响

采用肌肉注射、以3H标记的亮氨酸作为示踪氨基酸的大剂量方法、茚三酮测定氨基酸总量的方法,测定了摄食和禁食45 d的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)各组织、器官游离氨基酸量、吸收积累的试验氨基酸量、非蛋白质水溶液和蛋白质结合的放射性强度(dpm值)。结果表明,肌肉是草鱼蛋白质代谢最为活跃的组织,禁食使其蛋白质合成量下降了38%左右;脑保持着较高的、稳定的蛋白质代谢活动,其新的蛋白质合成量没有受到禁食的影响;肾脏积累了较多的游离形式的试验氨基酸,禁食并没有使其蛋白质合成量下降,反而有少量增加;肠道是蛋白质代谢活跃的内脏器官,禁食使其蛋白质合成量显著减少,仅为摄食组的30%左右;脾脏进行着较为活跃的蛋白质代谢,禁食45 d后脾脏非蛋白质水溶液和蛋白质结合的dpm值均较摄食组增加了161%,其新合成的蛋白质量为摄食条件下的2.6倍;禁食并没有使肝胰脏蛋白质合成量受到影响;心脏也进行着较为活跃的蛋白质代谢,禁食使其新的蛋白质合成量降低了一半左右。通过氨氮排泄率和排泄氨氮占体蛋白质氮百分比的分析结果,草鱼在禁食过程中整体蛋白质代谢活动在5 d以前快速下降,氨氮排泄率从第3 d的404.44μmol(N)/kg.h下降到第5 d的325.68μmol(N)/kg.h,5 d以后氨氮排泄率趋于稳定(水温在21.5℃),此时草鱼的氨氮排泄率为4.56 mg/kg.h、氨氮排泄的氮占鱼体蛋白质的百分比为0.37%,可以作为草鱼内源性氨氮的排泄参考值。     

草鱼生长阶段对赖氨酸需要量的研究

采用生长研究法来确定约草鱼的赖氨酸需要量,并对血清、肌肉和肝脏的游离赖氨酸迸行了检测.结果表明,按生长率最大值所确定的幼草鱼赖氨酸需要量为饲料中的1.611%按血清游离赖氨酸浓度最大值所确定的赖氨酸需要量为饲料的1.28%,明显低于生长研究法确定的结果.用肝脏和肌肉游离赖氨酸浓度为指标确定的赖氨酸需要量分别为饲料的1.46%和1.49%,这与生长研究法确定的赖氨酸需要量较接近.     

四氯乙烯和镉对草鱼的单一与联合毒性效应

以静水生物测试法研究了四氯乙烯和重金属镉对草鱼的单一与联合毒性,同时采用Marking相加指数法对二者的联合毒性进行了评价.单一毒性试验表明:四氯乙烯对草鱼24、48、72和96 h的半数致死浓度(LC₅₀)分别为49.12、41.68、36.37和34.30 mg·L^-1;镉对草鱼24、48、72和96h的LC₅₀分别为45.58、34.81、28.63和24.05mg·L^-1;二者对草鱼均有毒性,而且为高毒,镉的毒性大于四氯乙烯.联合毒性试验表明:二者毒性比为1∶1,暴露时间为24、48、72和96 h时四氯乙烯和镉的LC₅₀分别为24.63、12.54、9.88和7.08 mg·L^-1以及17.11、8.71、6.87和4.92 mg·L^-1,相加指数AI(additive index)分别为0.14、0.81、0.95和1.43,联合作用结果为协同效应,并且随着时间的增加,协同作用增强;二者浓度比为1∶1, 暴露时间为24、48 、72和96 h时四氯乙烯和镉的LC₅₀分别为17.00、11.18、10.61和9.19 mg·L^-1,AI分别为0.39、0.70、0.51和0.54,联合作用为协同作用.     

三倍体草鲂杂种及其双亲的细胞遗传学研究

用空气干燥法制片,Giemsa染色,检查草鱼、三角鲂及其杂交一代(简称草鲂杂种)的肾细胞染色体。双亲的二倍染色体均为48,草鲂杂种的染色体数目为72。草鱼染色体组型:20M+20SM+8ST;三角鲂染色体组型:18M+22SM+8ST,其亚中部着丝点染色体中有一对大型特征性标志染色体。根据比较双亲和草鲂杂种染色体组型特征,证实草鲂杂种是三倍体,组型为29M+31SM+12ST。其中草鱼提供了两份染色体,三角鲂提供了一份染色体。推测草鲂杂种染色体加倍原因是受精过程中卵子核内有丝分裂或第二极体的保留。       

四种抗脂肪肝物质降低草鱼肝胰脏脂质积累的替代关系

采用１１种添加不同水平的蛋氨酸（Ｍｅｔ）,胆碱（Ｃｈ）甜菜碱（Ｂｅｔ）和大豆卵磷脂（Ｌｅｃ）的饲料饲养初始体重约１５ｇ的草鱼,研究了它们降低草鱼肝胰脏脂质积累的相互替代关系,１１种饲料中这四种物质的含量分别为（％）：（１）１．１Ｍｅｔ０．０８Ｃｈ,（２）１．１Ｍｅｔ０．３３Ｃｈ,（３）１．３Ｍｅｔ０．２３Ｃｈ,（４）１．５Ｍｅｔ０．１３Ｃｈ,（５）１．３Ｍｅｔ０．１３Ｃｈ,（６）１．３Ｍｅｔ０．１